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一、实验目的
1.通过实验理解掌握食品中化学危害检测分析的一般步骤。
2.掌握HPLC分析表征食品中四环素类抗生素的一般方法和操作过程。
3．了解掌握固相萃取(SPE)纯化样品的基本操作。
二、实验原理

     四环素类抗生素是以并四苯为基本骨架，仅在5、6、7位取代基不同的一类由放线菌产生的广谱抗生素。在畜禽生产中，四环素类药物多用于防治肠道感染、促生长等，同时也被应用于养蜂中预防和治疗多种感染性疾病，因此可能造成成蜂产品中四环素类抗生素的残留。蜂蜜是人们非常喜欢的一类食品，长期服用受四环素类抗生素污染的蜂蜜会严重危及人类的身体健康，其毒性反应主要表现对胃、肠、肝、肾的损害以及对牙齿和骨骼的破坏等，因此，蜂蜜中四环素类抗生素残留成为重要的监控对象。
    蜂蜜除了含有大量的多糖和有机酸类物质还有各种维生素、矿物质和氨基酸，而四环素类抗生素属高极性的两性化合物，在酸性和碱性条件下均不稳定，且含有许多羟基、烯醇羟基及羰基，在中性条件下能与多种金属离子形成不溶性螯合物。因此，在样品提取、纯化过程中，通过控制样品溶剂的pH值、以及采用Na2EDTA-Mcllvaine 缓冲液等方式使四环素类抗生素以分子形式吸附在固相萃取柱上，而蜂蜜中的大部分基质被淋洗弃除，以降低蜂蜜样品的背景干扰，再选用适宜的洗脱液将四环素类抗生素洗脱下来，即可采用HPLC测定分析。
    固相萃取柱（SPE） 是从层析柱发展而来的一种用于萃取、分离、浓缩的样品前处理装置，其原理基于液-固相色谱理论，采用选择性吸附、选择性洗脱的方式对样品进行富集、分离、净化，是一种包括液相和固相物理萃取过程。较常用的方法是使液体样品溶液通过吸附剂，保留其中被测物质，再选用适当强度溶剂冲去杂质，然后用少量溶剂迅速洗脱被测物质，从而达到快速分离净化与浓缩的目的。
    根据分离模式不同，SPE可分为正相、反相、离子交换、混合机理分离模式。 反相固相萃取萃取柱填料一般有以下几种：C18、C8、C4、CN、Ph；正相固相萃取萃取柱填料一般有以下几种：极性官能团键合硅胶（如 CN、NH2、二醇基）和极性吸附物质（Al2O3、硅、硅酸镁、活性炭等）；离子交换分为阴离子(WAX、SAX)和阳离子(WCX、SCX)交换，阳离子填料通常用硅胶上键合磺酸钠盐、碳酸钠盐等作为阳离子交换固定相，阴离子常用脂肪族季铵盐、氨基键合作为固定相。Waters Oasis HLB固相萃取小柱吸附剂是由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物，其保留机理为反相，是可用于酸性、中性和碱性化合物的通用型吸附剂，适用于分析蜂蜜中四环素类抗生素残留。
三、仪器与试剂
仪器：HPLC、色谱工作站、固相萃取仪、离心机等。
试药：甲醇、乙腈（色谱纯）；磷酸氢二钠、柠檬酸、乙二胺四乙酸二钠、草酸，均为分析纯；去离子水等。
对照品：四环素、土霉素、金霉素、强力霉素
样品：蜂蜜
四、实验步骤
1. 溶液的配制
1.1 磷酸氢二钠溶液：0.1mol/L 称取14.20g磷酸氢二钠，用水溶解，定容至1000mL
1.2 柠檬酸溶液：0.1mol/L 称取21.01g柠檬酸，用水溶解，定容至1000mL
1.3 Mcllvaine缓冲溶液：将1000mL 0.1mol/L柠檬酸溶液与625mL 0.1mol/L磷酸氢二钠溶液混合，必要时用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH=4.0±0.05
1.4 Na2EDTA-Mcllvaine 缓冲液：0.1mol/L  称取60.5g乙二胺四乙酸二钠放入1625mL Mcllvaine缓冲溶液中，使其溶解，摇匀。
1.5甲醇-水（1:19）混合溶液：量取5mL甲醇与95mL水混合
2. 对照溶液的配制
    将四环素、土霉素、金霉素、强力霉素配成混合对照溶液，以1mg/ml浓度作为储备液，然后用流动相稀释成浓度为50 μg/ml，作为对照溶液。
3. 样品溶液的配制
3.1提取
     称取蜂蜜2g，置于50mL三角瓶中，加入30mLNa2EDTA-Mcllvaine 缓冲液，快速混合1min，使样品完全溶解。将样品溶液倒入10mL离心管中，以3000r/min离心5min，待纯化。
3.2 SPE纯化
①SPE柱活化：HLB固相萃取柱：30mg，1mL；使用前分别用1mL甲醇和1mL水预处理，流速<3mL/min，保持柱体湿润。
②上样：将3.1项下所得蜂蜜溶液的上清液倒入下接1.6项已活化好的 HLB柱的储液器中，上清液以<3mL/min的流速通过HLB柱。
③冲洗：待样品上清液完全流出后，用1mL甲醇-水（1:19）混合液洗脱，弃去全部流出液，在65kPa的负压下，减压抽干20min。
④洗脱：用流动相溶液1mL洗脱，收集洗脱液。
4. 分析过程
色谱条件：C18（50×2.1mm，1.8μm）色谱柱；流动相：乙腈：甲醇：0.01mol/L草酸溶液（18:12:70）；柱温为室温；测定波长350nm；流速：1.0mL/min；进样量：20μL。
分别取对照品溶液、3.2项下纯化后的样品溶液各20 μL注入色谱仪，记录峰面积，根据外标法计算样品四环素类抗生素残留量。
Cx=（Ax/AR）×CR
式中  Cx为供试品溶液抗生素X的浓度
      Ax为供试品溶液中抗生素X的峰面积
      CR为对照品溶液中抗生素X的浓度
      AR为对照品溶液中抗生素X的峰面积
五、思考题
1、HLB固相萃取柱选择洗脱液的原则？
2、流动相中采用0.01mol/L草酸溶液作为水相的原因？
3、分析提取过程中采用Na2EDTA-Mcllvaine 缓冲液的目的？

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